一、實(shí)驗(yàn)背景與原理

RNA交聯(lián)是通過(guò)物理或化學(xué)手段在RNA與RNA結(jié)合蛋白（RBP）之間形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的技術(shù)，用于研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用。UV紫外交聯(lián)是目前最主流的方法：利用路陽(yáng)UCL-3200/3500紫外交聯(lián)儀254 nm短波紫外光照射活細(xì)胞，當(dāng)RNA堿基（主要是尿嘧啶）與蛋白質(zhì)氨基酸殘基距離足夠近時(shí)，紫外光激發(fā)堿基π電子，使其與蛋白質(zhì)側(cè)鏈形成共價(jià)鍵。這種"零長(zhǎng)度交聯(lián)"無(wú)需化學(xué)試劑介入，僅捕獲直接接觸的分子對(duì)，背景低、定位精確，是CLIP（交聯(lián)免疫沉淀）技術(shù)的核心基礎(chǔ)。CLIP技術(shù)已發(fā)展出HITS-CLIP、iCLIP（單核苷酸分辨率）、PAR-CLIP（光活化核苷增強(qiáng)，需365 nm）、eCLIP等多個(gè)衍生版本，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品準(zhǔn)備：培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度80%-90%，預(yù)冷PBS洗滌2次，吸盡PBS。

2. UV紫外交聯(lián)（核心步驟）：打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，置于路陽(yáng)UCL-3200/3500紫外交聯(lián)儀腔體中央，254 nm波長(zhǎng)、能量模式設(shè)置150 mJ/cm2（0.150 J/cm2），關(guān)閉艙門啟動(dòng)。路陽(yáng)UCL-3200/3500紫外交聯(lián)儀可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)輻照能量，達(dá)標(biāo)后自動(dòng)停止并蜂鳴提醒。取出后立即冰上操作，刮取細(xì)胞，4°C離心收集沉淀。

3. 細(xì)胞裂解與RNA片段化：預(yù)冷裂解液（含蛋白酶/ RNase抑制劑）冰上裂解30 min，離心取上清。加入RNase I 37°C孵育5-10 min，將RNA切割為30-60 nt片段。

4. 免疫沉淀：加入目標(biāo)蛋白特異性抗體4°C孵育2-4 h，再加Protein A/G磁珠孵育1-2 h。高鹽洗滌液洗3次，常規(guī)洗滌液洗2次。

5. 接頭連接與標(biāo)記：去磷酸化后用T4 RNA連接酶連接3'端接頭，再用T4 PNK和[γ-32P]ATP進(jìn)行5'端放射性標(biāo)記。

6. SDS-PAGE與轉(zhuǎn)膜：樣品上樣10% Bis-Tris凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜。放射自顯影定位RBP-RNA復(fù)合物條帶，切下對(duì)應(yīng)膜區(qū)。

7. RNA回收與測(cè)序：Proteinase K消化膜上蛋白質(zhì)，酚-氯仿抽提回收RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增（含barcode），切膠純化150-300 bp片段，Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序。

三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：上海路陽(yáng)紫外交聯(lián)儀UCL-3200/3500

路陽(yáng)UCL-3200/3500紫外交聯(lián)儀兩款均為微處理器控制的254 nm紫外輻照系統(tǒng)，適用于核酸膜交聯(lián)、RNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、PCR污染消除等場(chǎng)景，同時(shí)提供302 nm（M型）和365 nm（L型）可選。

四、設(shè)備優(yōu)勢(shì) (路陽(yáng)UCL-3200/3500紫外交聯(lián)儀)

1. 微處理器閉環(huán)控制：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)紫外強(qiáng)度，達(dá)到預(yù)設(shè)能量自動(dòng)停止，燈管老化也不影響交聯(lián)劑量一致性，結(jié)果可重現(xiàn)。

2. 紫外光強(qiáng)高度均勻：鏡面發(fā)射板加橘面反射板組合，紫外交聯(lián)儀腔體內(nèi)任意位置輻照強(qiáng)度一致。

3. 傳感器防護(hù)：紫外傳感器配石英玻璃防護(hù)罩，隔絕化學(xué)試劑污染，檢測(cè)精度長(zhǎng)期穩(wěn)定，維護(hù)成本低。

4. 極速啟動(dòng)：無(wú)需預(yù)熱，樣品處理流程緊湊。

5. 操作便捷：9組預(yù)設(shè)能量值，開(kāi)機(jī)記憶上次設(shè)置，一鍵調(diào)用；交聯(lián)完成蜂鳴提醒并自動(dòng)待機(jī)，無(wú)需值守。

6. 參數(shù)應(yīng)用廣泛：能量0.000-99.99 J/cm2、時(shí)間0-599.5 min，覆蓋CLIP、膜交聯(lián)、紫外滅活等多種場(chǎng)景。

7. 安全可靠：全封閉腔體屏蔽紫外輻射，打開(kāi)自動(dòng)停止。

五、注意事項(xiàng) (路陽(yáng)UCL-3200/3500紫外交聯(lián)儀)

1. 紫外安全：254 nm紫外可損傷皮膚和眼睛，操作時(shí)確保艙門關(guān)閉，嚴(yán)禁輻照中開(kāi)門。

2. RNase防控：全程無(wú)RNase操作，耗材需無(wú)RNase級(jí)，操作臺(tái)用RNase Zap清潔，佩戴無(wú)粉手套并勤換，樣品始終保持冰上。

3. 交聯(lián)能量?jī)?yōu)化：不同細(xì)胞和蛋白最佳劑量不同，建議50-400 mJ/cm2梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)，能量過(guò)低信號(hào)弱、過(guò)高導(dǎo)致RNA降解。

4. 對(duì)照設(shè)置：必須設(shè)未交聯(lián)對(duì)照（No CL）、IgG同型對(duì)照、Input對(duì)照，排除假陽(yáng)性。

5. 樣品保存：紫外交聯(lián)后，細(xì)胞沉淀-80°C可存1-2個(gè)月，避免反復(fù)凍融；放射性樣品按規(guī)范處理。

6. 設(shè)備維護(hù)：定期清潔腔體和燈管，石英罩用乙醇輕擦，燈管約2000小時(shí)壽命需及時(shí)更換，每年校驗(yàn)輻照精度。

下圖：紫外交聯(lián)儀UCL-3500